2.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（Calibration Curve）

標(biāo)準(zhǔn)曲線反映了所測定物質(zhì)濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系，一般用回歸分析方法（如用加權(quán)最小二乘法）所得的回歸方程來評價。應(yīng)提供標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)，說明其線性相關(guān)程度。標(biāo)準(zhǔn)曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內(nèi)濃度測定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度。

配制標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)使用與待測樣品相同生物介質(zhì)，不同生物樣品應(yīng)配制標(biāo)準(zhǔn)樣品制備各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)濃度個數(shù)取決于分析物可能的濃度范圍和分析物/響應(yīng)值關(guān)系的性質(zhì)。必須至少用6個濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對于非線性相關(guān)可能需要更多濃度點。定量范圍要能覆蓋全部待測的生物樣品濃度范圍，不得用定量范圍外推的方法求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點，僅用于評價干擾。標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點的實測值與標(biāo)示值之間的偏差^* 在可接受的范圍之內(nèi)時，可判定標(biāo)準(zhǔn)曲線合格?？山邮芊秶话阋?guī)定為最低濃度點的偏差在±20%以內(nèi)，其余濃度點的偏差在±15%以內(nèi)。只有合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能對臨床待測樣品進(jìn)行定量計算。當(dāng)線性范圍較寬的時候，推薦采用加權(quán)的方法對

^*  ：偏差=[（實測值－標(biāo)示值）/標(biāo)示值]X100%標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，以使低濃度點計算得比較準(zhǔn)確。

2.3.定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）

定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點，表示測定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度。LLOQ應(yīng)能滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1／10～1／20時的藥物濃度。其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實濃度的80%～120%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明。

2．4. 精密度與準(zhǔn)確度(Prcision and Accuracy)

精密度是指在確定的分析條件下，相同介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測量值的分散程度。通常用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間RSD來考察方法的精確度。一般RSD應(yīng)小于15％，在LLOQ附近RSD應(yīng)小于20％。

準(zhǔn)確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度(即質(zhì)控樣品的實測濃度與真實濃度的偏差)，重復(fù)測定已知濃度分析物樣品可獲得準(zhǔn)確度。一般應(yīng)85％～115％范圍內(nèi)，在LLOQ附近應(yīng)在80％～120％范圍內(nèi)。

一般要求選擇高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品同時進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。低濃度選擇在LLOQ的3倍以內(nèi)，高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，中間選一個濃度。在測定批內(nèi)精密度時，每一濃度至少制備并測定5個樣品。為獲得批間精密度應(yīng)至少在不同天連續(xù)制備并測定3個分析批(Analytical run/Analytical batch)，至少45個樣品。

2.5. 樣品穩(wěn)定性(Stability)

根據(jù)具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時間進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應(yīng)注意考察儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

2.6.提取回收率

從生物樣本基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值除以純標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的響應(yīng)值即為分析物的提取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物提取出來供分析的比例。應(yīng)考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)一致、精密和可重現(xiàn)。

2.7. 微生物學(xué)和免疫學(xué)方法確證

上述分析方法確證主要針對色譜法，很多參數(shù)和原則也適用于微生物學(xué)或免疫學(xué)分析，但在方法確證中應(yīng)考慮到它們的一些特殊之處。微生物學(xué)或免疫學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線本質(zhì)上是非線性的，所以應(yīng)采用比化學(xué)分析更多的濃度點來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果的準(zhǔn)確度是關(guān)鍵的因素，如果重復(fù)測定能夠改善準(zhǔn)確度，則應(yīng)在方法確證和未知樣品測定中采用同樣的步驟。

微生物學(xué)或免疫學(xué)分析方法確證實驗應(yīng)包括在幾天內(nèi)進(jìn)行的6個分析批，每個分析批包括4個濃度（LLOQ，低、中、高濃度）的質(zhì)控雙樣本。

3. 方法學(xué)質(zhì)控

只有在生物樣本分析方法確證完成之后才能開始測定未知樣品。在測定生物樣品中的藥物濃度時應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證所建立的方法在實際應(yīng)用中的可靠性。推薦由獨立的人員配制不同濃度的質(zhì)控樣品對分析方法進(jìn)行考核。（這樣保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，也減少誤差）

每個未知樣品一般測定一次，必要時可進(jìn)行復(fù)測。生物等效性試驗中，來自同一個體的生物樣品最好在同一批中測定。每個分析批生物樣品測定時應(yīng)建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品。每個濃度至少雙樣本，并應(yīng)均勻分布在未知樣品測試順序中。當(dāng)一個分析批中未知樣品數(shù)目較多時，應(yīng)增加各濃度質(zhì)控樣品數(shù)，使質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度點偏差一般應(yīng)小于20%，最多允許1/3不在同一濃度的質(zhì)控樣品結(jié)果超限。如質(zhì)控樣品測定結(jié)果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結(jié)果作廢。

濃度高于定量上限的樣品，應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測定。對于濃度低于定量下限的樣品，在進(jìn)行藥代動力學(xué)分析時，在達(dá)到C_max以前取樣的樣品應(yīng)以零值計算，在達(dá)到C_max以后取樣的樣品應(yīng)以無法定量（Not detectable, ND）計算，以減小零值對AUC計算的影響。

4. 分析數(shù)據(jù)的紀(jì)錄與報告提交

在分析報告中，應(yīng)提交完成這些實驗工作的相關(guān)資料。建立一般性和特殊性標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、保存完整的實驗記錄是分析方法有效性的基本要素。